Поиск

TMR DN - это нетоксичный для клеток зонд на основе 5-карбокситетраметилродамина (TMR) и контактного тушителя динитроанилина (DN), способный проникать в клетку через клеточную мембрану. Коровая часть молекулы представляет собой ароматический фрагмент с отрицательно-заряженной карбоксильной группой и обладает выраженными флуоресцентными свойствами, при этом уменьшает неспецифическое связывание с геномной ДНК или РНК. Сенсоры на основе РНК-аптамеров и TMR DN используются для внутриклеточной визуализации мРНК, рРНК в живых прокариотических и эукариотических клетках. Тандемные повторы аптамеров (например, SRB-2) могут быть преимуществом для визуализации менее стабильных РНК и тех РНК, количества которых в клетке очень малы. Преимуществом системы SRB-2/TMR DN является ее высокая яркость, сравнимая с GFP (зеленым флуоресцентным белком), при меньших размерах комплекса. SRB-2 также полностью ортогонален Spinach/Broccoli аптамерам, перекрестная реактивность между аптамерами и их лигандами (TMR DN и DFHBI) отсутствует, что позволяет использовать TMR DN и SRB-2 в комбинации с другими парами зонд/аптамер для визуализации и изучения динамики одновременно нескольких РНК [1]. Максимумы возбуждения и флуоресценции комплекса SRB-2/TMR DN составляют 561 и 587 нм соответственно и находятся в оранжевой области спектра, где собственная клеточная автофлуоресценция довольно низкая [2].

Данный фосфорамидит используется для синтеза олигонуклеотидов, меченых TAMRA на 5’-конце. TAMRA (карбокситетраметилродамин) — ксантеновый краситель родаминового ряда с эмиссией в оранжевой области спектра (максимум на 563 нм). Данный флуорофор традиционно используется в качестве FRET-акцептора (и тушителя) в паре с флуоресцеином (FAM) благодаря значительному перекрытию их спектров. Поэтому данный фосфорамидит удобно использовать для синтеза дважды меченых зондов TaqMan, содержащих TAMRA на 5’-конце и FAM в середине последовательности или на 3’-конце (с использованием Флуоресцеин dT фосфорамидита и FAM CPG соответственно). 5’-меченые красителем TAMRA олигонуклеотиды часто используются для количественной ПЦР и фрагментного анализа (например, для анализа микросателлитов), поскольку доступное оборудование часто имеет канал детекции для TAMRA. Поскольку краситель TAMRA не стабилен в присутствие аммиака и первичных стерически незатрудненных аминов, настоятельно рекомендуется соблюдать указанные условия деблокирования меченых олигонуклеотидов.

Олигоэтиленгликоли - гидрофильные линкеры, находящие применение в биоконъюгации. Данная бифункциональная молекула на основе короткого линкера диэтиленгликоля (ПЭГ2) содержит аминогруппу, которую можно модифицировать путем ацилирования (ангидридами и активированными эфирами), восстановительного аминирования (реакции с альдегидами и кетонами в присутствии восстановителя), алкилирования (эпоксидами, галогенидами), а также с помощью других реакций. Другая функциональная группа - алкиновая - вступает в медь-катализируемую реакцию диполярного циклоприсоединения с азидами (CuAAC) и палладий-катализируемую реакцию Соногаширы с арил- и винилгалогенидами и трифлатами.

Готовый набор для мечения антител красителем sulfo-Cyanine3 dye, эквивалентом Cy3®. Этот набор содержит все необходимые компоненты (реагенты и расходные материалы) для того, чтобы провести 10 реакций мечения (до 100 мкг антитела на реакцию). Очистка продукта осуществляется с помощью гель-фильтрации на спин-колонках, включенных в набор. Точное измерение количества красителя гарантирует воспроизводимый результат мечения и оптимальное число молекул красителя на молекулу антителаe. Очищенные меченые антитела в буфере PBS будут готовы через 40 минут (из них только 10 минут работы руками). Набор совместим с Трис-буфером, азидом натрия, глицерином.

sulfo-Cyanine3 — сульфированное производное красителя Cyanine3, хорошо растворимое в воде за счет наличия в структуре красителя двух отрицательно заряженных сульфогрупп. По спектральным свойствам является аналогом Cy™3 с максимумом флуоресценции в желто-оранжевой области спектра. Гидразиды эффективно взаимодействуют с альдегидами и кетонами с образованием гидразонов, поэтому данное соединение хорошо подходит для коньюгации с карбонильными производными биомолекул. Реакция проходит в водных условиях, что важно при работе с антителами и многими другими белками. Цис-диольные группы в сахарах в структуре гликозилированных белков и антител можно окислить в диальдегиды, а цистеин в белках можно ферментативно превратить в формилглицин — реакционноспособные группы для конъюгации с гидразидом sulfo-Cyanine3. Карбоксильные группы аспарагиновой и глутаминовой кислот в белках и пептидах также могут быть конъюгированы с гидразидом sulfo-Cyanine3 в присутствии активирующих агентов: производных карбодиимида (EDAC) или метилморфолина (DMTMM).

Азид-ПЭГ3-йодид - бифункциональный линкер, содержащий высокореакционноспособную иодидную группу. Этот иодид с высокой скоростью алкилирует различные C-, O-, N-, S-нуклеофилы. Органические иодиды примерно на порядок активнее бромидов, и на 4 порядка активнее хлоридов в реакциях замещения, протекающих по механизму SN2. Это означает, что реакция алкилирования иодидом займет в 10 раз меньше времени, чем аналогичная реакция алкилбромида. Поэтому эта молекула позволяет проводить алкилирование очень быстро. ПЭГ3 - гидрофильный линкер средней длины. Азидогруппу можно вводить в реакции клик-химии и лигирования по Штаудингеру. Ее также легко восстановить в аминогруппу.

Флуоресцеин (чистый 5-изомер) в виде производного тетразина (метилтетразина). Тетразины - реакционноспособные гетеродиеновые компоненты для реакции [4+2] циклоприсоединения с обращенными электронными требованиями. Второй компонент реакции - напряженные циклоалкены (транс-циклооктены и циклопропены). Эта реакция также называется ТЦО (транс-циклооктеновым) лигированием. Эта реакция - одна из наиболее быстрых реакций биоконъюгации.

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству аннексинов, внутриклеточных белков, связывающих фосфолипиды. Аннексин V обычно используется в проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии для определения апоптотических клеток, благодаря его способности специфически связываться с фосфатидилсерином (ФС) кальций-зависимым образом. Метод был впервые описан Koopman с соавт. (1994) [1]. В здоровых клетках ФС содержится только с внутренней стороны плазматической мембраны. Во время апоптоза мембранная асимметрия исчезает, ФС перемещается на наружную сторону мембраны и становится доступным для связывания флуоресцентно меченным Аннексином V. В сочетании с другими прижизненными красителями, такими как йодистый пропидий (PI), метод позволяет различать популяции здоровых (Annexin−PI−), апоптотических (Annexin+PI−) и некротических (Annexin+PI+) клеток [2].Готовый набор содержит все необходимые реагенты для мечения апоптотических клеток с помощью Аннексина V, конъюгированного с AF 647, и PI. AF 647 — яркий флуоресцентный краситель, излучающий в дальнем красном канале, с высоким квантовым выходом флуоресценции и высокой фотостабильностью. Спектр AF 647 сильно отстоит от зелено-желтых длин волн, что делает этот флуорофор незаменимым для мечения клеток, обладающих высокой автофлуоресценцией. Максимум поглощения красителя — 655 нм. Максимум эмиссии — 680 нм. PI — непроницаемый сквозь плазматическую мембрану ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК краситель излучает в оранжево-красном канале. Максимум поглощения — 535 нм. Максимум эмиссии — 617 нм.

Активированный N-гидроксисукцинимидный (NHS) эфир красителя AMCA (ацетат аминометилкумарина). Активированные эфиры обладают реакционной способностью в отношении первичных и вторичных аминогрупп. С их помощью можно метить аминогруппы в белках, пептидах, амино-модифицированных олигонуклеотидах и других целевых молекулах. AMCA — один из самых ярких синих флуоресцентных красителей. Этот флуорофор имеет относительно большой стоксов сдвиг, высокую устойчивость к фотовыгоранию и рН-независимую флуоресценцию в диапазоне рН от 4 до 10. АМСА широко используется для многоцветного мечения из-за минимального перекрытия его флуоресценции с зелеными и более длинноволновыми флуоресцентными красителями.

 Преимущества набора: • ДНК из любых реакционных смесей, фрагменты длины от 70 до 20000 п. о. • Показатели А260/280 = 1,80±0,05, А260/230 ≥ 2,0 • Выделенный ПЦР-продукт пригоден для проведения лигирования, рестрикции, трансформации, секвенирования, ПЦР.

Cyanine3B один из самых ярких флуорофоров, обладающий высокой чувствительностью. Малеимид производное используют для приготовления тиол-малеимидных конъюгатов посредством мечения по тиоловым группам антител, пептидов и других биомолекул Cyanine3B флуорофором с высокими квантовым выходом и фотостабильностью. Способ присоединения по Михаэлю тиолов к малеимидам позволяет метить антитела с высокой селективностью. Этот сульфонированный цианиновый краситель можно использовать для проведения реакции в водных буферных системах после предварительного приготовления раствора Cyanine3B малеимида в полярном растворителе (ДМФА, ДМСО).

Флуоресцеин (FAM) — один из наиболее известных флуоресцентных красителей. Это производное FAM содержит циклооктиновый фрагмент (дибензоциклооктин, ДБЦО). Чистый 6-изомер. ДБЦО быстро и эффективно реагирует с азидами при простом смешении компонентов, без необходимости использования медного катализатора (т.н. стерически промотированная реакция циклоприсоединения, или SPAAC). FAM ДБЦО можно использовать для мечения белков, пептидов, нуклеиновых кислот и других молекул с азидогруппами. Флуоресценцию FAM можно детектировать с помощью множества различных приборов.