Поиск

Применение: Предназначен для изучения метилирования ДНК. Позволяет определить наличие сайтов R(5mC)GY в заданной точке ДНК человека. Набор рассчитан на 200 реакций. Включает 1, 3 или 5 гибридных праймеров по выбору заказчика, либо полный набор из 32 гибридных праймеров (HP). При оформлении заказа, пожалуйста, выберите необходимые вам гибридные праймеры. Их структура приведена в Инструкции по применению Состав: 1X TE буфер – 200 мкл 10Х SE TMN Буфер – 160 мкл ДМСО – 80 мкл БСА, 10 мг/мл – 70 мкл MD-эндонуклеаза (20 е.а./мкл) – 10 мкл Универсальный адаптер, двухцепочечный (10 μM) – 110 мкл АТФ, 10 mM – 110 мкл Т4 ДНК лигаза (200 е.а./мкл) – 100 мкл 10X SE GLAD буфер – 430 мкл MgCl2, 50 mM – 120 мкл Смесь dNTP, 10 mM каждый – 90 мкл SP Taq ДНК Полимераза, 5 е.а./мкл – 40 мкл Контрольная ДНК Raji, 18 нг/мкл – 10 мкл Контрольная ДНК HeLa, 18 нг/мкл – 10 мкл Контрольная ДНК фага Lambda, 18 нг/мкл – 25 мкл Контрольня смесь для URB1 (праймеры и флюоресцентный зонд), 10 μM каждый – 40 мкл Контрольня смесь для CEBPD (праймеры и флюоресцентный зонд), 10 μM каждый – 15 мкл В состав включены 1, 3 или 5 гибридных праймеров по выбору заказчика, либо полный набор из 32 гибридных праймеров в концентрации 20 μM и количестве 170 мкл каждый. Последовательности 32 гибридных праймеров приведены в Инструкции по применению Условия хранения: Хранить при -20°C Примечание: Для проведения GLAD ПЦР анализа в реакционную смесь на стадии ПЦР необходимо добавить геномный праймер, зонд, а также один из гибридных праймеров. Геномный праймер и зонд могут быть синтезированы по дополнительному заказу.

Сайт узнавания и позиция гидролиза: GCTCTTCN GCTCTTCN↑ CGAGAAG(N)4 CGAGAAG(N)4↓ Источник: Planococcus citreus S Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: ДНК фага лямбда Оптимальный буфер: SE-буфер B Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 100 50 75 50 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM KCl; 0,1 mM EDTA; 200 ug/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 3-кратным избытком фермента около 90% фрагментов ДНК сшиваются Т4 ДНК-лигазой и около 95% из них могут быть повторно расщеплены Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 0.5 ед фермента в течение 16 часов при 37°С Чувствительность к метилированию: не проверялось С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер B.

Сайт узнавания и позиция гидролиза: GGCGCC GG↑CGCC CCGCGG CCGC↓GG Источник: Micrococcus lylae 113 Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага T7 за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: ДНК фага Т7 Оптимальный буфер: SE-буфер B Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 100 25 10 10 50 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 200 ug/ml BSA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 3-кратным избытком фермента более 80% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 2 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. Чувствительность к метилированию: не проверялось С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер B. Примечание: Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности.

Описание: Мы предлагаем 10хSE-буферы, оптимизированные для работы с нашими ферментами. 10хSE-буферы обеспечивают оптимальные реакционные условия для достижения 100% активности, производимых нами ферментов (эндонуклеаз рестриции). Каждый фермент поставляется в комплекте с рекомендованным 10хSE-буфером. Некоторые ферменты требуют специфические реакционные условия, поэтому для них созданы индивидуальные кратные SE-буферы. Также некоторым эндонуклеазам рестриции для достижения 100% активности дополнительно требуется бычий сывороточный альбумин (BSA) или S-аденозил-L-метионин (SAM). Когда это необходимо, данные реактивы поставляются в комплекте с ферментом и 10хSE-буфером. Состав: 1X(10 mM Tris-HCl (pH 8.5 при 25°C); 10 mM MgCl2; 100 mM NaCl; 1 mM DTT.) Условия хранения: Хранить при -20°C. Допускается хранение буфера при 4-10°C в течение 3 месяцев. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер.

Сайт узнавания и позиция гидролиза: AGATCT A↑GATCT TCTAGA TCTAG↓A Источник: Из штамма E.coli несущего клонированный ген BglII из Bacillus globigii Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: ДНК фага лямбда Оптимальный буфер: SE-буфер O Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 10 100 25 10 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 10-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 20 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. Чувствительность к метилированию: Не блокируется dam-метилированием при перекрывании (GmATC): AGATCTС ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер O. Для фасовок Turbo (E027T и E028T) прикладывается только буфер ROSE.

Сайт узнавания и позиция гидролиза: CCNGG CC↑NGG GGNCC GGN↓CC Источник: Micrococcus species R9 Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда (dcm-) за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: ДНК фага лямбда (dcm-) Оптимальный буфер: SE-буфер O Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 50 50 100 50 50 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 100 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 100 ug/ml BSA; 7 mM2-меркаптоэтанол; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 2-кратным избытком фермента <5% фрагментов ДНК сшиваются и могут быть повторно расщеплены. Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 40 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. Чувствительность к метилированию: Блокируется при перекрывании dcm-метилированием (CmCWGG): CCWGG. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер O.

Сайт узнавания и позиция гидролиза: RCCGGY R↑CCGGY YGGCCR YGGCC↓R Источник: Bacillus stearothermophilus 118 Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 65°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: ДНК фага лябда Оптимальный буфер: SE-буфер O Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 50 100 75 25 100 Условия хранения: 10 mM KH2PO4(pH 7.5); 100 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 100 ug/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°C. Лигирование: После гидролиза 5-кратным избытком фермента более 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 10 ед фермента в течение 16 часов при 65°C. Чувствительность к метилированию: не проверялось С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер O.

MD ДНК эндонуклеаза Glu I. Метилзависимая ДНК эндонуклеаза отличается от эндонуклеаз рестрикции тем, что режет ДНК исключительно при наличии метильных групп в сайте узнавании. При отсутствии метилирования гидролиз отсутствует. Сайт узнавания и позиция гидролиза: G(5mC)NG(5mC) G(5mC)↑NG(5mC) (5mC)GN(5mC)G (5mC)GN↓(5mC)G Источник: Glacial ice bacterium GL24 Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента, необходимое для полного гидролиза единственного сайта 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` в 1 мкг линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. При этом происходит исчезновение исходной линейной формы плазмиды pFsp4HI3/DriI (см. рисунок ниже, дор. 4). Появление дополнительных продуктов гидролиза (см. рисунок ниже, дор. 4-6) является результатом последующего расщепления ДНК по сайтам 5`-GCNGC-3`/3`-CGNCG-5`, имеющим три 5-метилцитозина. Субстрат для определения активности: Субстрат pFsp4HI3/DriI представляет собой ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI. Плазмида pFsp4HI3 содержит фрагмент геномной ДНК бактериального штамма Flavobacterium sp. 4H, включающий ген ДНК-метилтрансферазы M.Fsp4HI, и один канонический сайт: 5`-G(5mC)NG(5mC)-3`/3`-(5mC)GN(5mC)G-5` [2]. Оптимальный буфер: SE-буфер Y Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 75 75 25 50 100 100 Условия хранения: 10 mM KH2PO4 (pH 7.45); 200 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 200 мкг/мл BSA, 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: Неспецифический гидролиз: Не наблюдается неспецифического гидролиза при инкубации 1 ед фермента Glu I с 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 16 часов при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Чувствительность к метилированию: Фермент расщепляет только C5-метилированную ДНК. Не расщепляет немодифицированную ДНК. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер Y.

Термолабильная щелочная фосфатаза удаляет фосфаты с 5`- и 3`-концов ДНК, РНК и ДНТФ. Может быть использована вместо антарктической фосфатазы Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2 Описание: Термолабильная щелочная фосфатаза (англ. TAP) катализирует дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Определение единицы активности: За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,5 мл реакционной смеси за 15 мин при 16°C. Реакционная смесь содержала 1Х SE-буфер W, 10 mM пара-нитрофенилфосфат. Оптимальный буфер: SE-буфер W Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°:C); 0.1 mM ZnCl2; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Примечание: Термолабильную щелочную фосфатазу не рекомендуется разбавлять ввиду возможной потери активности. Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК плазмиды pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1Х SE -буфер W и 1 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 16°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli,получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/Hind III. Протокол дефосфорилирования 5′-концов ДНК с помощью ТАР после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР): На 20 мкл реакционной смеси: 10Х SE буфер ЭР (или буфер “W”) – 2 мкл, ДНК – 0,5-1мкг, деионизованная вода – до 20 мкл. Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием. Инкубировать в течении 0,5-1 часа при оптимальной температуре. Охладить реакционную смесь во льду в течение 1-2 мин!!! Добавить 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы (Е365/Е366), перемешать пипетированием. Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 16°C(при 25°C активность фермента составляет 75-100%). Прогреть реакционную смесь при 65°C в течение 20 мин. Можно использовать обработанную ДНК для дальнейших экспериментов. Если требуется, очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или высадить 96%-ным этанолом.

Сайт узнавания и позиция гидролиза: GATC GAT↑C CTAG C↓TAG Источник: Bacillus stearothermophilus KT Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда (dam-) за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: ДНК фага лямбда (dam-) Оптимальный буфер: SE-буфер W Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 25 50 75 100 50 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 100 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 100 ug/ml BSA; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 5-кратным избытком фермента около 90% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 5 ед фермента в течение 16 часов при 37°С Чувствительность к метилированию: Блокируется dam-метилированием (GmATC): 5`-G(6mA)TC-3`/3`-CT(6mA)G-5` Не блокируется CG метилированием. Гидролизует полуметилированный по аденину сайт: 5`-G(6mA)TC-3`/3`-CTAG-5` С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер W.

Описание: Мы предлагаем 10хSE-буферы, оптимизированные для работы с нашими ферментами. 10хSE-буферы обеспечивают оптимальные реакционные условия для достижения 100% активности, производимых нами ферментов (эндонуклеаз рестриции). Каждый фермент поставляется в комплекте с рекомендованным 10хSE-буфером. Некоторые ферменты требуют специфические реакционные условия, поэтому для них созданы индивидуальные кратные SE-буферы. Также некоторым эндонуклеазам рестриции для достижения 100% активности дополнительно требуется бычий сывороточный альбумин (BSA) или S-аденозил-L-метионин (SAM). Когда это необходимо, данные реактивы поставляются в комплекте с ферментом и 10хSE-буфером. Состав: 1X(67 mM Tris-HCl (pH 8.8 при 25°C); 6.7 mM MgCl2; 16.7 mM (NH4)2SO4; 1 mM DTT.) Условия хранения: Хранить при -20°C. С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер.

Сайт узнавания и позиция гидролиза: CACNNNGTG CACNNN↑GTG GTGNNNCAC GTG↓NNNCAC Источник: Из штамма E.coli несущего клонированный ген DraIII из Deinococcus radiophilus Определение единицы активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг ДНК фага лямбда за 1 час при 37°С в 50 мкл реакционной смеси. Субстрат для определения активности: ДНК фага лямбда Оптимальный буфер: SE-буфер 2K Активность фермента в различных буферах в процентах от максимальной: B G O W Y ROSE 25 50 75 75 50 100 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 300 mM NaCl; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 200 μg/ml BSA; 50% глицерин; Хранить при -20°С. Лигирование: После гидролиза 10-кратным избытком фермента 70% фрагментов ДНК сшиваются ДНК-лигазой и могут быть повторно расщеплены. В присутствии 10% ПЭГ сшивка более эффективна. Неспецифический гидролиз: Картина специфического гидролиза не изменяется при обработке 1 мкг ДНК 5 ед фермента в течение 16 часов при 37°С. Чувствительность к метилированию: не проверялось С ферментом поставляется: 10 Х SE-буфер 2K, BSA. Для фасовок Turbo прикладывается 10 X SE-буфер ROSE. Примечание: Большой избыток фермента приводит к появлению звездчатой активности. Для достижения 100% активности BSA следует добавлять в реакционную смесь до концентрации 100 мкг/мл. BSA при длительной инкубации использовать не рекомендуется.