Эндонуклеаза I

Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген Неорганической пирофосфатазы из Thermococcus litoralis. Описание: Катализирует гидролиз неорганического пирофосфата с образованием ортофосфата.Фермент чрезвычайно термостабилен. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 40 нмолей фосфата за 1 мин из пирофосфата в стандартных условиях реакции (50 мМ Tris-HCl (pH 8.5); 1 mM MgCl2; 0.32 mM Ppi) при 75°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Неорганическая пирофосфатаза Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6); 0.1 mM EDTA; 100 mM KCl, 0.2% Tween-20; 50% глицерин. Хранить при -20°С.

Расщепляет все формы ДНК и РНК (одноцепочечные, двуцепочечные, линейные и кольцевые) до олигонуклеотидов длиной 3-5 нуклеотидных остатка с 5`-фосфатом на конце. Фермент активен в диапазоне значений pH от 7,5 до 8,5 и диапазоне температур от 20 до 37°С. Применение: – расщепление природных или денатурированных нагреванием ДНК и РНК; – уменьшение вязкости образцов при очистке белков; – удаление нуклеиновых кислот из клеточных или бактериальных лизатов. Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего клонированный ген Sma-нуклеазы из Serratia marcescens. Условия хранения: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50% глицерин. Хранить при -20°С. Определение активности: Олигонуклеотидный дуплекс 5′-AGCAAATATTGCTCGATATC-3′ 3′-TCGTTTATAACGAGCTATAG-5′ Единица активности: За единицу активности принимается количество фермента, необходимое для гидролиза 1 мкг олигонуклеотидного дуплекса указанной структуры за 30 мин при 37°С в SE-буфере B в 20 мкл реакционной смеси. Условия реакции и определения активности: 1 x SEBuffer B. Инкубировать при 37°C. Чистота: >90% (SDS-PAGE) Температурная инактивация: Фермент не инактивируется прогреванием при 65-80°С в течение 20 минут. Состав прилагаемого буфера: 1 x SEBuffer B (pH 7.6 @ 25ºC) 10 mМ Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT.

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантный ген Taq-ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus.. Описание: Катализирует матричный синтез ДНК путем переноса нуклеотида от dNTP на 3` конец ДНК Определение единицы активности: За одну единицу активности Taq ДНК полимеразы принимали количество фермента,необходимое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 72°С. Оптимальный буфер: SE-буфер ДНК полимераза Taq Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6); 100 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0,5 % Тритон Х-100; 50% глицерин. Хранить при -20°С

Источник: Выделена из штамма E.coli, содержащего клонированный ген полинуклеитидкиназы из бактериофага Т4 Описание: Катализирует перенос (и обмен) концевой фосфатной группы АТФ на 5`-гидроксильную группу ДНК (РНК). Определение единицы активности: За одну единицу активности Т4 полинуклеотидкиназы принимали количество фермента, необходимое для включения 1 нмоля [32P] в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер полинуклеотидкиназа T4 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl;0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 50% глицерин. Хранить при -20°С.

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего клонированный ген I фага T7. Описание: Катализирует синтез РНК, используя в качестве матрицы ДНК, содержащую промотор фага Т7. T7 РНК полимераза используется для приготовления меченого РНК зонда и для проведения транскрипции in vitro. Определение единицы активности: За одну единицу активности T7 РНК полимеразы принимали количество фермента необходимое для включения 1 нмоля NTP в кислотонерастворимую фракцию за 60 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Т7 РНК полимераза Условия хранения: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5); 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 20 mM 2-меркаптоэтанол; 0,1% Тритон Х-100; 50% глицерин. Хранить при -20°C.

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантный ген Taq-ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus.. Описание: Катализирует матричный синтез ДНК путем переноса нуклеотида от dNTP на 3` конец ДНК Определение единицы активности: За одну единицу активности Taq ДНК полимеразы принимали количество фермента,необходимое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 72°С. Оптимальный буфер: SE-буфер AS (Ammonium Sulfate) Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6); 100 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0,5 % Тритон Х-100; 50% глицерин. Хранить при -20°С

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантную плазмиду. Описание: Катализирует синтез ДНК в 5` -> 3` направлении и требует присутствия матрицы и праймера. Имеет 3` -> 5` экзонуклеазную активность. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер ДНК полимераза T4 Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM KCl; 10 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°C.

Термолабильная щелочная фосфатаза удаляет фосфаты с 5`- и 3`-концов ДНК, РНК и ДНТФ. Может быть использована вместо антарктической фосфатазы Источник: Выделена из штамма E.coli несущего клонированный ген щелочной фосфатазы из Alteromonas undina P2 Описание: Термолабильная щелочная фосфатаза (англ. TAP) катализирует дефосфорилирование 5`- и 3`-концов ДНК и РНК. Также гидролизует рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Определение единицы активности: За единицу активности принимали количество фермента, необходимое для гидролиза 1 μмоля пара-нитрофенилфосфат (PNPP) в 0,5 мл реакционной смеси за 15 мин при 16°C. Реакционная смесь содержала 1Х SE-буфер W, 10 mM пара-нитрофенилфосфат. Оптимальный буфер: SE-буфер W Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6 при 25°:C); 0.1 mM ZnCl2; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Примечание: Термолабильную щелочную фосфатазу не рекомендуется разбавлять ввиду возможной потери активности. Функциональный тест: В результате обработки 1 мкг ДНК плазмиды pUC19/HindIII в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1Х SE -буфер W и 1 мкл препарата фермента, в течение 30 мин при 16°C и последующей сшивки с помощью Т4 ДНК лигазы и трансформации клеток E.coli,получали >10-кратное уменьшение числа выросших колоний по сравнению с использованием необработанной ДНК pUC19/Hind III. Протокол дефосфорилирования 5′-концов ДНК с помощью ТАР после гидролиза эндонуклеазой рестрикции (ЭР): На 20 мкл реакционной смеси: 10Х SE буфер ЭР (или буфер “W”) – 2 мкл, ДНК – 0,5-1мкг, деионизованная вода – до 20 мкл. Добавить 1 мкл эндонуклеазы рестрикции, перемешать пипетированием. Инкубировать в течении 0,5-1 часа при оптимальной температуре. Охладить реакционную смесь во льду в течение 1-2 мин!!! Добавить 1 мкл (5 ед.) щелочной фосфатазы (Е365/Е366), перемешать пипетированием. Инкубировать в течение 0,5-1 часа при 16°C(при 25°C активность фермента составляет 75-100%). Прогреть реакционную смесь при 65°C в течение 20 мин. Можно использовать обработанную ДНК для дальнейших экспериментов. Если требуется, очистить ДНК гель-фильтрацией, на спин-колонках или высадить 96%-ным этанолом.

Источник: Выделена из рекомбинантного штамма E.coli экспрессирующего ген ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus YT1 Описание: Hot Start Taq ДНК-полимераза является сложной смесью термостабильной Taq ДНК-полимеразы молекулярной массой 94 kDa и специфических моноклональных антител из мыши. Hot Start Taq неактивна в условиях приготовления реакции амплификации. Это позволяет исключать такие артефакты амплификации как образование димеров праймеров и ошибочное праймирование на протяжении стадии преамплификации и таким образом может улучшать специфичность по сравнению со стандартными ДНК полимеразами. Преимуществом Hot Start Taq является отсутствие дополнительного нагрева для активации полимеразы. Тепловая активация фермента происходит в течение первой денатурации. Неактивный комплекс Hot Start Taq диссоциирует автоматически при повышении температуры выше + 70 °C, приводя к активации ДНК-полимеразы. Катализирует матричный синтез ДНК путем переноса нуклеотида от dNTP на 3`конец ДНК. Применение: Высокоспецифичная PCR Мультиплексная PCR (особенно рекомендуется) Высокочувствительные применения Определение единицы активности: За одну единицу активности принимается количество фермента требуемое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 минут при 74 °C Оптимальный буфер: SE-буфер ДНК полимераза Hot Start Taq Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0); 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50 % глицерин; 0.5 % Nonidet P-40, 0.5 % Tween-20. Хранить при -20°С. С ферментом поставляется: 10 x SE-буфер Hot Start Taq ДНК полимераза, MgCl2.

Источник: Из штамма E.coli, несущего рекомбинантный ген Описание: Урацил-ДНК-гликозилаза катализирует высвобождение свободного урацила из урацил-содержащих ДНК. UDG эффективно гидролизует урацил из одно- и двуцепочечных ДНК, но не из олигомеров (6 или менее оснований) Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для высвобождения 60 пмолей урацила за 1 мин из двуцепочечной урацил-содержащей ДНК при 37°С. Активность измеряется по высвобождению меченого[3Н]–урацила в 50 мкл рекционной смеси, содержащей 0,2 мкг ДНК (8.7 х 104cpm/μg) за 30 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Урацил ДНК гликозилаза Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6); 50 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1mM DTT; 50% глицерин. Хранить при -20°С.

Источник: Выделен из штамма E.coli, содержащего ген ДНК-полимеразы (Фрагмент Кленова) Описание: Продукт протеолиза ДНК Полимеразы I (E.coli), у которого сохраняется полимеразная и экзонуклеазная активность в направлении 3`->5`, но отсутствует экзонуклеазная активность в направлении 5`->3`. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для перевода 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Фрагмент Кленова Условия хранения: 10 mM KH2PO4(pH 7.5); 50 mM KCl; 0.5 mM EDTA; 10 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°C.

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантный ген Taq-ДНК-полимеразы из Thermus aquaticus.. Описание: Катализирует матричный синтез ДНК путем переноса нуклеотида от dNTP на 3` конец ДНК Определение единицы активности: За одну единицу активности Taq ДНК полимеразы принимали количество фермента,необходимое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 72°С. Оптимальный буфер: SE-буфер ДНК полимераза Taq (без MgCl2) Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6); 100 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0,5 % Тритон Х-100; 50% глицерин. Хранить при -20°С

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантную плазмиду. Описание: TaqSE ДНК полимераза является сложной смесью термостабильных ДНК-полимераз. Катализирует матричный синтез ДНК путем переноса нуклеотида от dNTP на 3` конец ДНК. Препарат TaqSE ДНК полимеразы обеспечивает более высокую точность копирования ДНК, уменьшает количество побочных продуктов. Может образовывать продукты с тупыми концами благодаря наличию 3`->5` экзонуклеазной активности. Выход продукта может быть выше по сравнению с Taq ДНК полимеразой. Определение единицы активности: За одну единицу активности TaqSE ДНК полимеразы принимали количество фермента,необходимое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин при 72°С. Оптимальный буфер: SE-буфер ДНК полимераза Taq Условия хранения: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6); 100 mM KCl; 0.1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0,5 % Тритон Х-100; 50% глицерин. Хранить при -20°С Примечание: Не для рутинного использования, для специального применения! Протокол для проведения ПЦР с TaqSE ДНК полимеразой отличается от протокола проведения ПЦР с Taq ДНК полимеразой. TaqSE ДНК полимераза при использовании ферментативно синтезированных трифосфатов (Смесь dNTP(ферм.) для ПЦР 2.5mM каждого, кат.номер N026) тестирована в ПЦР при амплификации фрагмента ДНК фага Т7 длиной 15 тыс. пар нуклеотидов.

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантную плазмиду. Описание: РНК зависимая ДНК полимераза. Катализирует матричный синтез ДНК используя в качестве матрицы РНК или одноцепочечную ДНК. Необходим праймер. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для включения 1 нмоля dТTP в кислотонерастворимую фракцию, образуемую на матрице поли (rA) с олиго (dT)-праймера за 10 мин при 37°С. Оптимальный буфер: SE-буфер Обратная транскриптаза M-MuLV Условия хранения: 10 mM Калия фосфат (pH 7.5); 0,1 mM EDTA; 200 mM NaCl; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Примечание: Высокая концентрация фермента может привести к ингибированию ОТ-ПЦР. В этом случае следует разбавить препарат фермента в 5, 10 или 20 раз буфером для разбавления M-MuLV ревертазы (прилагается).

Источник: Выделена из штамма E.coli, несущего рекомбинантную плазмиду, содержащую модифицированный ген ДНК полимеразы Pyrococcus furiosus. Описание: PfuSE ДНК полимераза является улучшенным (более стабильным) вариантом Pfu ДНК полимеразы. PfuSE ДНК полимераза обладает 3`-5` экзонуклеазной корректирующей активностью (proof-reading activity), что позволяет ферменту, в отличие от Taq ДНК полимеразы, вести точный синтез ДНК. PfuSE ДНК полимераза образует продукты ПЦР с тупыми концами. Определение единицы активности: За одну единицу активности принимали количество фермента, необходимое для включения 10 нмолей dNTP в кислотонерастворимую фракцию ДНК за 30 мин при 72°C. Оптимальный буфер: SE-буфер PfuSE ДНК полимераза Условия хранения: 10 mM калий-фосфат (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 0.1% Тритон Х-100, 0.5 % Tween-20, 50% глицерин. Хранить при -20°С. Примечание: Не используйте dUTP в ПЦР.

Источник: Выделена из штамма E.coli, инфицированного фагом Т4. Описание: Применяется преимущественно для сшивки тупых концов. Катализирует образование фосфодиэфирной связи между 5`-фосфатной и 3`-гидроксильными концевыми группами ДНК (РНК). Определение единицы активности: За одну единицу активности Т4 ДНК лигазы принимали количество фермента, необходимое для 50% сшивки HindIII-фрагментов ДНК фага лямбда за 30 мин при 16°С в 20 мкл реакционной смеси при концентрации ДНК 300 mkg/ml. Оптимальный буфер: SE-буфер ДНК лигаза T4 Условия хранения: 10 mM Tris-HCl (pH 7.5); 50 mM NaCl; 0,1 mM EDTA; 7 mM 2-меркаптоэтанол; 50% глицерин. Хранить при -20°С. Примечание: В буфере для Т4 ДНК лигазы допускается выпадение осадка. В этом случае необходимо перед использованием нагреть буфер до 37°С и встряхнуть его несколько раз до исчезновения осадка.Кроме того, стоит избегать многократного замораживания/оттаивания буфера.Поэтому после первой разморозки рекомендуется расфасовать буфер небольшими объемами в отдельные пробирки, хранить при -20°C,и не размораживать аликвоты более 2-3 раз. Допускается хранение размороженного буфера при +4°С в течение 7 дней.