LumiMount среда для флуоресцентных препаратов

Тирамидная амплификация (TSA) — самый универсальный и эффективный способ усиления интенсивности флуоресцентного сигнала, применяемый в иммуногистохимии (ИГХ, IHC), иммуноцитохимии (ICC) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Метод TSA основан на способности пероксидазы хрена (HRP) в присутствии низких концентраций пероксида водорода превращать меченый тираминсодержащий субстрат в окисленный, высокореактивный свободный радикал, который ковалентно связывается с остатками тирозина белковых молекул, расположенных рядом с ним. По сравнению с обычными процедурами, метод TSA увеличивает чувствительность иммунофлуоресцентного обнаружения целевых молекул более чем в 100 раз, благодаря чему он особенно подходит для обнаружения мишеней с низкой концентрацией. В применениях, где не требуется повышение чувствительности обнаружения, TSA позволяет значительно снижать концентрации антител или зондов без потери интенсивности сигнала, и тем самым уменьшать фоновое окрашивание, возникающее из-за перекрестной реактивности или неспецифического связывания антител. Поскольку связывание тирамидной метки является ковалентным, тирамиды разных красителей можно использовать в нескольких последовательных раундах TSA-окрашивания, для обнаружения нескольких мишеней в одном и том же образце. Данный тирамид — конъюгат водорастворимого дальне-красного флуоресцентного красителя sulfo-Cyanine5.5. sulfo-Cyanine5.5 тирамид (также известный как Cy5.5® и Cyanine5.5 тирамид у других производителей) является компонентом многих наборов для тирамидной амплификации сигнала. Этот реагент можно использовать с любым антителом или другими молекулами (стрептавидин и др.), конъюгированными с HRP, для окрашивания клеток и тканей методами иммунофлуоресценции.

Тирамидная амплификация (TSA) — самый универсальный и эффективный способ усиления интенсивности флуоресцентного сигнала, применяемый в иммуногистохимии (ИГХ, IHC), иммуноцитохимии (ICC) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Метод TSA основан на способности пероксидазы хрена (HRP) в присутствии низких концентраций пероксида водорода превращать меченый тираминсодержащий субстрат в окисленный, высокореактивный свободный радикал, который ковалентно связывается с остатками тирозина белковых молекул, расположенных рядом с ним. По сравнению с обычными процедурами, метод TSA увеличивает чувствительность иммунофлуоресцентного обнаружения целевых молекул более чем в 100 раз, благодаря чему он особенно подходит для обнаружения мишеней с низкой концентрацией. В применениях, где не требуется повышение чувствительности обнаружения, TSA позволяет значительно снижать концентрации антител или зондов без потери интенсивности сигнала, и тем самым уменьшать фоновое окрашивание, возникающее из-за перекрестной реактивности или неспецифического связывания антител. Поскольку связывание тирамидной метки является ковалентным, тирамиды разных красителей можно использовать в нескольких последовательных раундах TSA-окрашивания, для обнаружения нескольких мишеней в одном и том же образце. Данный тирамид — конъюгат водорастворимого красителя sulfo-Cyanine7 с флуоресценцией в ближней инфракрасной области спектра. sulfo-Cyanine7 тирамид (также известный как Cy7® и Cyanine7 тирамид у других производителей) является компонентом многих наборов для тирамидной амплификации сигнала. Этот реагент можно использовать с любым антителом или другими молекулами (стрептавидин и др.), конъюгированными с HRP, для окрашивания клеток и тканей методами иммунофлуоресценции.

LumiMount DAPI — заливочная среда на водной основе, содержащая DAPI (4’,6-диамидино-2-фенилиндол), для заключения под покровные стекла и визуализации флуоресцентно меченных образцов клеток или тканей. DAPI — синий флуоресцентный краситель, который прочно связывается с участками ДНК, богатыми аденином и тимином, и используется для контрастирования клеточных ядер, а также для окрашивания хромосом. DAPI демонстрирует ~20-кратное усиление флуоресценции при связывании с двухцепочечной ДНК с максимумами поглощения при 358 нм и испускания при 461 нм. LumiMount DAPI совместим с большинством флуоресцентных маркеров, используемых в микроскопии. Он препятствует выцветанию флуорохромов во время визуализации благодаря содержанию специального anti-fade агента. Коэффициент преломления жидкой заливочной среды составляет 1.38, но данный показатель может увеличиваться до 1.46 по мере испарения воды из-под покровного стекла. LumiMount DAPI обеспечивает полупостоянную герметизацию препаратов, достаточную для их длительного хранения при температуре от +2°C до +8°C. Поскольку LumiMount DAPI растворяется в воде, покровное стекло можно снять, погрузив препарат в раствор PBS до тех пор, пока покровное стекло не отделится. Для большей герметизации препарата рекомендуется заклеивать края покровного стекла водонепроницаемым лаком.

Hoechst 34580 (бисбензимид, HOE 34580) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 34580 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 34580 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 380/438 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 34580 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 34580 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 34580 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Hoechst 34580 способен проникать в живые клетки, однако его клеточная проницаемость меньше, чем Hoechst 33342. Как и все красители его семейства, Hoechst 34580 менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 34580 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 34580 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 34580 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл.

AF 430 — гидрофильный флуорофор. Он используется в проточной цитометрии и других флуоресцентных методах. Функциональная группа — активированный эфир — позволяет проводить эффективную конъюгацию флуорофора с первичными и вторичными аминами (в том числе белками и антителами) в среде водных буферов и безводных органических растворителях.

LUCS 13 — проникающий в клетки ядерный краситель, имеющий яркую зеленую флуоресценцию при связывании с нуклеиновыми кислотами. LUCS 13 является полным структурным аналогом SYTO®13. LUCS 13 используют для окрашивания РНК и ДНК как в живых, так и в мертвых эукариотических клетках, а также грамположительных и грамотрицательных бактерий. Краситель возбуждается при 488 нм, эмиссия регистрируется во флуоресцеиновом канале с пиком 509 нм после связывания с ДНК и 514 нм после связывания с РНК. Краситель может использоваться совместно с непроникающими в живые клетки ядерными маркерами, такими как YoDi-3, для оценки клеточной выживаемости методами флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

Hoechst 33342 (бисбензимид, HOE 33342) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 33342 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 33342 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 351/461 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 33342 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 33342 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 33342 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Дополнительная этильная группа в Hoechst 33342 делает его более проникающим для клеток, чем DAPI и другие красители семейства Hoechst. Hoechst 33342 обладает в 10 раз большей клеточной проницаемостью, чем Hoechst 33258. Hoechst 33342 также менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 33342 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 33342 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 33342 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл. Мы предлагаем Hoechst 33342 в виде сухого вещества (1H010), концентрированного 10 мг/мл водного раствора (2G010), а также в готовой к использованию форме (скоро в продаже).

Азидопроизводное красителя AF 555 для конъюгации с терминальными алкинами посредством медь-катализируемой клик-реакции или с напряженными алкинами посредством безмедной безмедной клик-реакции. AF 555 — гидрофильный флуорофор с высокими квантовым выходом флуоресценции и фотостабильностью, альтернатива тетраметилродамину (TAMRA, TMR) и Cyanine3. Он предназначен для различных применений, включая цитометрию и микроскопию.

Флуоресцентно меченый азид, реагирующий с алкинильными производными биомолекул (терминальными алкинами и циклооктинами) посредством клик-реакций с образованием устойчивых аддуктов. AF 647 — яркий, фотостабильный и гидрофильный флуорофор, излучающий в дальнем красном канале (максимум поглощения — 650 нм, максимум излучения — 671 нм). Азид AF 647 применяется для мечения клеток и их детекции с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии.

TO-TAP-3 (мономер Тиазолового Красного также известный как TO-PRO®-3) — мономерный краситель на основе карбоцианина с флуоресценцией в дальней красной части спектра. TO-TAP-3 — непроникающий в живые клетки ядерный краситель, который не флуоресцирует в отсутствие нуклеиновых кислот. Краситель многократно усиливает свою флуоресценцию при связывании с двуцепочечной ДНК. TO-TAP-3 обладает ярким сигналом и низкой фоновой флуоресценцией. Он используется для окрашивания нуклеиновых кислот на микрочипах, а также для контрастного окрашивания ядер и хромосом в микроскопии. TO-TAP-3 может использоваться для мониторинга жизнеспособности клеток и обнаружения мертвых клеток в культуре. Длинноволновая флуоресценция TO-TAP-3 сильно отстоит от зеленого и красного каналов, что делает этот краситель идеальным для экспериментов с многоцветным флуоресцентным мечением.

Буфер для приготовления рабочих растворов мембранных красителей серии PKH. Буфер не требует предварительного разбавления и полностью готов к применению. Данный буфер для разведения входит в готовые наборы для мечения клеточных мембран красителями PKH26, PKH2 и PKH800. Буфер для разведения PKH поставляется как набор из пяти стерильных контейнеров по 10 мл 1× дилюента в каждом. Рекомендуется хранить в холодильнике и доводить до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

Тетраацетилированный N-(4-пентиноил)глюкозамин (Ac4GlcNAl) — меченый алкином моносахарид, который используется в качестве инструмента для исследования гликопротеинов путем метаболического мечения in vivo и последующего хемоселективного лигирования. Ac4GlcNAl — проникающий внутрь клеток искусственный сахар, который метаболизируется и встраивается в клетку вместо своего природного моносахаридного аналога — N-ацетилглюкозамина (GlcNAc). Образующиеся при этом алкинсодержащие гликопротеины могут быть обнаружены с помощью медь-катализируемой (CuAAC) клик-реакции с флуоресцентно-мечеными азидами или биотин-азидом.

Тетраацетилированный N-(4-пентиноил)галактозамин (Ac4GalNAl) — меченый алкином моносахарид, который используется в качестве инструмента для исследования гликопротеинов путем метаболического мечения in vivo и последующего хемоселективного лигирования. Ac4GalNAl — проникающий внутрь клеток искусственный сахар, который метаболизируется и встраивается в клетку вместо своего природного моносахаридного аналога — N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Образующиеся при этом алкинсодержащие гликопротеины могут быть обнаружены с помощью медь-катализируемой (CuAAC) клик-реакции с флуоресцентно-мечеными азидами или биотин-азидом.

VdU (5-винил-2’-дезоксиуридин) — синтетический аналог тимидина, который можно использовать для изучения синтеза ДНК de novo и клеточной пролиферации. VdU может служить потенциальной заменой другим тимидиновым аналогам — BrdU (5-бром-2’-дезоксиуридину) и EdU (5-этинил-2’-дезоксиуридину). VdU способен встраиваться в реплицирующуюся ДНК вместо природного тимидина во время S-фазы клеточного цикла. Полученную таким образом винилсодержащую ДНК можно детектировать тетразинами, конъюгированными с биотином или флуоресцентными красителями, с помощью безмедной алкен-тетразиновой реакции (также известной как лигирование Дильса-Альдера, или IEDDA), и использовать в дальнейшем для пурификации ДНК или визуализации клеток методами микроскопии или цитометрии.

5-Винилуридин (VU) представляет собой производное уридина с концевой алкеновой группой, использующееся для исследования и мониторинга транскрипции РНК в клетках вместо 5-этинилуридина (EU). Винилуридин легко поглощается живыми клетками и включается РНК-полимеразами вместо эндогенного уридина в новосинтезированные молекулы РНК, но не в ДНК [1]. Синтезированная de novo РНК, меченная винилуридином, может быть затем обнаружена с помощью быстрой и высокочувствительной реакции циклоприсоединения с обращенными электронными требованиями Дильса-Альдера (IEDDA) между винильной группой и флуоресцентно- или биотин-меченым тетразином. Меченую РНК можно детектировать затем с помощью различных методов оценки уровня клеточной транскрипции, например, методами флуоресцентной микроскопии или проточной цитометрии.

sulfo-Cyanine5 — флуоресцентный краситель дальней красной области спектра, широко используемый для мечения биомолекул. Максимумы поглощения и эмиссии sulfo-Cyanine5 находятся на 646 и 662 нм, соответственно. Красители с максимумом флуоресценции в дальнем красном диапазоне (более 650 нм) широко используются в различных методах визуализации благодаря низкому уровню фоновой флуоресценции в данной области спектра. Кроме этого, они используются в мультиплексной детекции вместе с красителями ближнего красного, оранжевого, зеленого и синего диапазонов. Биотин, или водорастворимый витамин Н, играет важнейшую роль в реакциях клеточного метаболизма. Он с высокой аффинностью и некооперативно связывает авидин, гликопротеин белка куриного яйца, а также стрептавидин (бактериальный аналог авидина) и нейтравидин (дегликозилированный авидин). Таким образом, конъюгат sulfo-Cyanine5 с биотином может использоваться для качественной и количественной оценки сайтов связывания авидина в биологических образцах различного происхождения. Реагент хорошо растворим в воде, его флуоресценция не зависит от рН в диапазоне от pH 4 до pH 10. Гибкий ПЭГ3-линкер между биотином и sulfo-Cyanine5 предотвращает стерические затруднения при связывании конъюгата с авидином. Конъюгат sulfo-Cyanine5-биотин может использоваться в различных методах для визуализации целевых молекул (например, для мечения первичных и вторичных антител для Вестерн-блоттинга, иммуноанализа, цито- и гистохимии, проточной цитофлуориметрии), измерения констант связывания и диссоциации, биосенсоров на основе стрептавидина и т. д.