RAPID DiI, липофильный трейсер

Hoechst 33342 (бисбензимид, HOE 33342) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 33342 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 33342 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 351/461 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 33342 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 33342 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 33342 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Дополнительная этильная группа в Hoechst 33342 делает его более проникающим для клеток, чем DAPI и другие красители семейства Hoechst. Hoechst 33342 обладает в 10 раз большей клеточной проницаемостью, чем Hoechst 33258. Hoechst 33342 также менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 33342 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 33342 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 33342 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл. Мы предлагаем Hoechst 33342 в виде сухого вещества (1H010), концентрированного 10 мг/мл водного раствора (2G010), а также в готовой к использованию форме (скоро в продаже).

Cyanine3B активированный эфир — реакционноспособный краситель для специфического мечения аминогрупп в биомолекулах: антителах, пептидах или олигонуклеотидах. Cyanine3B — улучшенная версия желтого флуоресцентного красителя Cyanine3 с повышенными квантовым выходом и фотостабильностью.

Тетраметилродамин (TAMRA) - ксантеновый краситель с эмиссией в оранжевой области. Этот краситель является FRET-акцептором для флуоресцеина (FAM) и иногда используется как тушитель для него. TAMRA, как и другие ксантены, существует в виде двух изомеров (5- и 6-), обладающих очень близкими спектральными свойствами. Этот азид - производное 6-TAMRA. Его можно конъюгировать с терминальными алкинами с помощью медь-катализируемой реакции клик-химии (CuААЦ) , а также с напряженными циклоалкинами (например, циклооктинами) по реакции стерически промотируемого алкин-азидного циклоприсоединения (СПААЦ).

BDP 505/515 - бордипиррометеновый флуорофор для визуализации липидных мембран. Он характеризуется очень высокой яркостью, а также стабильностью в условиях облучения светом возбуждения в конфокальной микроскопии.

Флуоресцентный краситель метокси-хлор-флуоресцеин (иначе JOE), содержащий азидную группу. Чистый 5-изомер. Предназначен для модификации с помощью click-реакций. Эмиссия в желтой области спектра. Кристаллическое вещество от оранжевого до коричневого цвета. Хорошо растворим в диметилсульфоксиде, диметилформамиде и других полярных растворителях.

Буфер для приготовления рабочих растворов мембранных красителей серии PKH. Буфер не требует предварительного разбавления и полностью готов к применению. Данный буфер для разведения входит в готовые наборы для мечения клеточных мембран красителями PKH26, PKH2 и PKH800. Буфер для разведения PKH поставляется как набор из пяти стерильных контейнеров по 10 мл 1× дилюента в каждом. Рекомендуется хранить в холодильнике и доводить до комнатной температуры непосредственно перед использованием.

TO-TAP-3 (мономер Тиазолового Красного также известный как TO-PRO®-3) — мономерный краситель на основе карбоцианина с флуоресценцией в дальней красной части спектра. TO-TAP-3 — непроникающий в живые клетки ядерный краситель, который не флуоресцирует в отсутствие нуклеиновых кислот. Краситель многократно усиливает свою флуоресценцию при связывании с двуцепочечной ДНК. TO-TAP-3 обладает ярким сигналом и низкой фоновой флуоресценцией. Он используется для окрашивания нуклеиновых кислот на микрочипах, а также для контрастного окрашивания ядер и хромосом в микроскопии. TO-TAP-3 может использоваться для мониторинга жизнеспособности клеток и обнаружения мертвых клеток в культуре. Длинноволновая флуоресценция TO-TAP-3 сильно отстоит от зеленого и красного каналов, что делает этот краситель идеальным для экспериментов с многоцветным флуоресцентным мечением.

SynaptoProbe Green является аналогом FM®1-43 — зеленого флуоресцентного красителя, широко используемого для исследования синаптической активности в синапсах и нервно-мышечных соединениях путем окрашивания синаптических пузырьков. SynaptoProbe Green — водорастворимый и нетоксичный для клеток краситель, который не флуоресцирует в водной среде, но обладает сильной флуоресценцией после внедрения во внешний слой клеточной мембраны. Когда нейрон активно высвобождает нейротрансмиттеры, краситель интернализуется в синаптических пузырьках, тем самым окрашивая нервные окончания. SynaptoProbe Green можно использовать для визуализации синаптических пузырьков, их экзоцитоза и эндоцитоза в живых нейронах, выявления активно возбуждающихся нейронов и исследования активность-зависимых механизмов циркулирования везикул. SynaptoProbe Green также может быть использован для визуализации повреждений плазматической мембраны фибробластов.

Hoechst 34580 (бисбензимид, HOE 34580) — проникающий в клетки синий флуоресцентный краситель, прочно связывающийся с богатыми аденином и тимином областями малой бороздки двухцепочечной ДНК. Хотя Hoechst 34580 может связываться со всеми нуклеиновыми кислотами, именно связывание его с нитями дцДНК, богатыми А и Т, значительно усиливает флуоресценцию красителя. Комплекс Hoechst 34580 с ДНК, имеет максимумы возбуждения/эмиссии при 380/438 нм соответственно. Интенсивность флуоресценции Hoechst 34580 увеличивается с увеличением pH растворителя. Несвязанный краситель флуоресцирует в диапазоне 510–540 нм. Зеленая флуоресценция несвязанного Hoechst 34580 может наблюдаться при использовании избыточной концентрации красителя или недостаточном отмывании образца. Hoechst 34580 имеет значительный стоксов сдвиг между спектрами возбуждения и излучения, что делает его идеальным для экспериментов с многоцветным мечением. Hoechst 34580 способен проникать в живые клетки, однако его клеточная проницаемость меньше, чем Hoechst 33342. Как и все красители его семейства, Hoechst 34580 менее токсичен, чем DAPI, что обеспечивает более высокую жизнеспособность окрашенных клеток. Hoechst 34580 широко используется во флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии для окрашивания хромосом и ядер в живых и фиксированных клетках. Краситель часто используется для различения конденсированных пикнотических ядер в апоптотических клетках и сортировки клеток. Флуоресценция Hoechst 34580 гасится бромдезоксиуридином (BrdU), обычно используемым для обнаружения делящихся клеток. Предполагается, что, когда BrdU интегрируется в ДНК, бром деформирует малую бороздку, не позволяя красителям Hoechst достичь оптимального места связывания. Это свойство Hoechst 34580 используется в исследованиях клеточного цикла. Обычно используемая концентрация красителя для окрашивания бактерий или клеток эукариот составляет 0,1–10 мкг/мл.

Di-8-ANEPPS представляет собой потенциал-чувствительный краситель семейства амино-нафтил-этенил-пиридиния (Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinium, ANEP), который широко используется в качестве быстрореагирующего индикатора мембранного потенциала. Краситель не флуоресцирует в несвязанном с мембранами состоянии и отвечает только на колебания электрического потенциала в окружающей его среде. Скорость оптического ответа Di-8-ANEPPS достаточна для обнаружения миллисекундных колебаний мембранного потенциала в возбудимых клетках, таких как отдельные нейроны и клетки сердца, а также для имиджинга интактного мозга. Величина потенциал-зависимого изменения флуоресценции красителя составляет около 2-10% на 100 мВ. Краситель также демонстрирует потенциал-зависимый сдвиг в спектре возбуждения, что позволяет количественно оценивать колебания мембранного потенциала с использованием ратиометрических подходов. Di-8-ANEPPS обладает более липофильными свойствами и лучше удерживается внешним слое клеточной мембраны, чем другие красители семейства ANEP, что делает его идеально подходящим для долгосрочных экспериментов. Поскольку Di-8-ANEPPS связывается с клеточной мембраной, он может быть также использован в качестве простого маркера плазматических мембран. Максимумы возбуждения/эмиссии Di-8-ANEPPS в метаноле составляют 498/713 нм соответственно. В липидах и клеточных мембранах спектры возбуждения и излучения красителя обычно смещены в синий цвет по сравнению с органическими растворителями. Di-8-ANEPPS можно вводить в клетки прямым добавлением стокового раствора в культуральную среду, с использованием мягкого детергента Pluronic® F-127 или методом ретроградного мечения. В качестве отправной точки используйте рабочую концентрацию 5-10 мкМ. Точную концентрацию красителя следует определять экспериментально.

HMRhoNox-M (также известный как LysoRhoNox) — Fe2+-селективный флуоресцентный индикатор, основанный на контролируемой N-оксидом спироциклизации тетраметил-гидроксиметилродамина. В отсутствие Fe2+ HMRhoNox-M находится в нефлуоресцентной спироциклической форме, демонстрируя лишь незначительную флуоресценцию в водных буферах и при физиологическом значении рН. Добавление Fe2+ вызывает 60-кратное увеличение флуоресценции при 575 нм за счет дезоксигенации диалкиламиногруппы и перехода индикатора в открытую флуоресцентную форму. HMRhoNox-M реагирует на Fe2+ дозозависимым образом. Флуоресцентный ответ HMRhoNox-M высокоизбирателен к Fe2+и не возникает на ионы других переходных металлов, включая Fe3+, а также ионы щелочных и щелочноземельных металлов. HMRhoNox-M — проникающий в клетки и локализующийся в основном в лизосомах индикатор. Он подходит для мониторинга изменений содержания эндогенного лабильного железа в живых клетках, в том числе захвата и транспорта железа трансферрином.

FluoriCa-8 AM — проникающий в живые клетки кальциевый индикатор. Краситель метаболизируется внутриклеточными эстеразами, после чего он способен связываться с Ca2+, что приводит к появлению ярко-зеленого флуоресцентного сигнала (λ возбуждения/испускания — 490/514 нм). FluoriCa-8 AM используется для детекции и измерения внутриклеточного Ca2+. Он прекрасно подходит для различных задач флуорометрии и имиджинга, таких как микроскопия, проточная цитометрия, спектрофлуориметрия и флуорометрический высокопроизводительный скрининг на микропланшетах. FluoriCa-8 AM похож по структуре и спектральным свойствам на Ca2+-индикаторы Fluo-3 AM и Fluo-4 AM, но обладает в сравнении с ними самой яркой флуоресценцией (в 2 раза ярче Fluo-4, и в 4 раза ярче Fluo-3). Значение Kd FluoriCa-8 AM для Ca2+ составляет около 389 нМ. Благодаря самой высокой интенсивности флуоресценции, FluoriCa-8 AM прекрасно подходит для задач, когда требуется минимизировать концентрацию загружаемого в клетки красителя. В отличие от Fluo-3 AM и Fluo-4 AM, которые требуют инкубации с клетками при 37°C, FluoriCa-8 AM можно загружать в клетки при комнатной температуре. Поскольку FluoriCa-8 AM не связывается ковалентно с клеточными компонентами, он может активно выводиться из клетки органическими переносчиками анионов, поэтому визуализация клеток in vivo с помощью FluoriCa-8 AM обычно выполняется в течение одного или двух часов после добавления красителя. При этом, краситель может быть повторно загружен в клетки, если это необходимо. FluoriCa-8 AM также можно фиксировать in situ с помощью EDC/EDAC для последующих окрашиваний методами иммунофлуоресценции. FluoriCa-8 AM имеет низкую растворимость в воде. Перед добавления к клеткам рекомендуется приготовить стоковый 1 мМ раствор красителя в ДМСО для мечения. Используйте конечную концентрацию 1–5 мкМ и инкубацию при комнатной температуре в течение 15–60 мин в качестве отправной точки вашего протокола.

Готовый набор, содержащий все необходимые реагенты для мечения мембран клеток красителем PKH2 с целью последующей оценки клеточной миграции или пролиферации. В наборе используется цианиновый краситель PKH2. В его структуре есть липофильные группы, позволяющие быстро и нековалентно встраиваться в клеточные мембраны практически любых клеток, не влияя на клеточные рецепторы или трансмембранные белки. При этом клетки сохраняют свои биологические свойства и способность к пролиферации, что делает PKH2 отличным флуорофором для изучения как растительных, так и животных клеток in vivo и in vitro. Он также подходит для изучения мембранных везикул. PKH2 испускает свет в зеленой области спектра, с максимумом флуоресценции 504 нм, его можно использовать наряду с другими красителями в многоцветных исследованиях. PKH2 менее стабилен, чем PKH26, и меченные им клетки могут быть исследованы с использованием микроскопии или проточной цитометрии в течение 10-11 дней после окрашивания. Количество измерений, на которое рассчитан набор, может отличаться в зависимости от количества клеток в образце: Набор, содержащий 100 µL красителя PKH2, позволяет проанализировать 25 образцов по 20 миллионов клеток в каждом, при использовании финальной концентрации красителя PKH2 равной 2×10-6 M. Набор, содержащий 500 µL красителя PKH2, позволяет проанализировать 125 образцов по 20 миллионов клеток в каждом, при использовании финальной концентрации красителя PKH2 равной 2×10-6 M. Рекомендуется определить оптимальные количество клеток и концентрацию красителя исходя из типа (ов) клеток и экспериментальных задач.

Di-4-ANEPPS представляет собой потенциал-чувствительный краситель семейства амино-нафтил-этенил-пиридиния (Amino-Naphthyl-Ethenyl-Pyridinium, ANEP), который широко используется в качестве быстрореагирующего индикатора мембранного потенциала. Краситель не флуоресцирует в несвязанном с мембранами состоянии и отвечает только на колебания электрического потенциала в окружающей его среде. Скорость оптического ответа Di-4-ANEPPS достаточна для обнаружения миллисекундных колебаний мембранного потенциала в возбудимых клетках, таких как отдельные нейроны и клетки сердца, а также для имиджинга интактного мозга. Величина потенциал-зависимого изменения флуоресценции красителя составляет около 2-10% на 100 мВ. Краситель также демонстрирует потенциал-зависимый сдвиг в спектре возбуждения, что позволяет количественно оценивать колебания мембранного потенциала с использованием ратиометрических подходов. Di-4-ANEPPS относительно быстро интернализуется клетками, поэтому его преимущественно используют для краткосрочных экспериментов. Мы также предлагаем краситель Di-8-ANEPPS, который обладает более липофильными свойствами и лучше удерживается во внешнем слое клеточной мембраны. Поскольку Di-4-ANEPPS связывается с клеточной мембраной, он может быть также использован в качестве маркера плазматических мембран и эндоцитоза. Максимумы возбуждения/эмиссии Di-4-ANEPPS в метаноле составляют 496/705 нм соответственно. В липидах и клеточных мембранах спектры возбуждения и излучения красителя обычно смещены в синий цвет по сравнению с органическими растворителями. Di-4-ANEPPS можно вводить в клетки прямым добавлением стокового раствора в культуральную среду, с использованием мягкого детергента Pluronic® F-127 или методом ретроградного мечения. В качестве отправной точки используйте рабочую концентрацию 5-10 мкМ. Точную концентрацию красителя следует определять экспериментально.

DND-167 (LysoSensor™ Blue DND-167, LysoView Blue) представляет собой проникающее в клетки слабое основание, которое после протонирования избирательно накапливается в везикулах с кислым содержимым. Краситель имеет высокий квантовый выход в кислой среде с pKa ~ 5,1, что позволяет ему визуализировать лизосомы и поздние эндосомы в живых клетках. DND-167 используют в качестве индикатора pH. Соединение имеет слабую флуоресценцию при нейтральных значениях pH, но становится значительно ярче в синей области спектра при значениях pH около 3,0. Максимумы возбуждения/эмиссии красителя составляют 370 и 425 нм соответственно. Краситель поставляется в виде 1 мМ раствора в ДМСО.

Липофильные карбоцианиновые трейсеры представляют собой цианиновые флуоресцентные красители, несущие длинные гидрофобные углеводородные хвосты. Данные красители обладают низкой флуоресценцией в водной среде, но демонстрируют ее значительное увеличение при включении в липидные бислои. Они эффективно и прочно маркируют цитоплазматические мембраны и внутриклеточные мембранные структуры различных типов клеток [1]. Карбоцианиновые красители используются в исследованиях, изучающих слияние клеток [2], клеточную адгезию [3] и миграцию [4], из-за их минимальной токсичности и отсутствию переносу красителя между клетками. Многоцветное окрашивание разных популяций клеток используют для последующей их идентификации после смешивания клеточных культур. Двойное мечение позволяет точно определить клетки, которые слились друг с другом, либо сформировали кластеры [5]. Кроме того, эти красители широко используются в качестве антероградных и ретроградных аксональных трейсеров в живых [1,6] и фиксированных [7,8] нервных тканях и клетках. Данный набор содержит образцы восьми карбоцианиновых красителей, обладающих различной скоростью мембранной диффузии, растворимостью и флуоресцентными свойствами: DiI (DiIC18(3); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцианин) — яркий и фотостабильный оранжево-красный флуоресцентный липофильный краситель, широко используемый для мечения мембран, трассировки клеток и аксонов, а также для визуализации методом микроскопии сверхвысокого разрешения STORM [9]. DiO (DiOC18(3); 3,3’-диоктадецилоксакарбоцианин) — широко используемый зеленый флуоресцентный липофильный краситель с меньшей скоростью латеральной диффузии в мембранах, чем у DiI. DiO часто используется вместе с DiI для двухцветного мечения. DiA (4-Di-16-ASP; 4-(4-(дигексадециламино)стирил)-N-метилпиридиния йодид) — желто-зеленый флуоресцентный липофильный краситель, который диффундирует гораздо быстрее, чем DiO, в клеточных мембранах. Он часто используется вместе с DiI для двухцветного мечения. DiD (DiIC18(5); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндодикарбоцианин) — аналог DiI со смещенными в красную область спектрами возбуждения и испускания флуоресценции, что позволяет избегать автофлуоресценции и фототоксических эффектов при визуализации. Краситель широко используется для многоцветного мечения и визуализации методом микроскопии сверхвысокого разрешения STORM [9]. DiR (DiIC18(7); 1,1’-диоктадецил-3,3,3’,3’-тетраметилиндотрикарбоцианин) — флуоресцентный липофильный краситель ближнего инфракрасного диапазона (NIR). Инфракрасная область спектра оптически прозрачна для многих тканей, поэтому DiR можно использовать для визуализации мелких животных in vivo [10] и микроскопии сверхвысокого разрешения STORM [9]. Neuro-DiO — зеленый флуоресцентный липофильный карбоцианиновый краситель. В отличие от DiO, Neuro-DiO обладает лучшей растворимостью в мембранах и менее склонен к образованию нефлуоресцентных агрегатов, снижающих скорость диффузии красителя. RAPID DiI (дилинолеил DiI; FAST DiI™; 1,1’-дилинолеил-3,3,3’,3’-тетраметилиндокарбоцинанин) — ненасыщенный аналог DiI с более высокой скоростью латеральной диффузии в клеточных мембранах, чем у исходного DiI. Данное свойство делает краситель особенно полезным для маркирования нейронов как в живых, так и в фиксированных тканях. RAPID DiO (дилинолеил DiO; FAST DiO™; 1,1’-дилинолеил-3,3’-оксакарбоцинанин) представляет собой ненасыщенный аналог DiO с более высокой скоростью латеральной диффузии в клеточных мембранах, чем у исходного DiO. Данное свойство делает краситель особенно полезным для маркирования нейронов как в живых, так и в фиксированных тканях.

Йодистый пропидий — непроникающий сквозь плазматическую мембрану интеркалирующий ДНК-краситель, позволяющий различать популяции некротических, апоптотических и здоровых клеток на основе целостности мембраны. После связывания с ДНК, краситель излучает в оранжево-красном канале с максимумом поглощения при 535 нм и максимумом эмиссии при 617 нм. Квантовый выход комплекса с ДНК в 20-30 раз выше свободного красителя. Йодистый Пропидий также связывается с РНК, поэтому для различения окрашивания РНК и ДНК требуется предварительная обработка препарата нуклеазами. Йодистый Пропидий также широко используется при флуоресцентном окрашивании и визуализации клеточной стенки растений. Мы предлагаем краситель в виде сухого вещества и в форме 0,1 мг/мл водного раствора. Водный раствор красителя является компонентом Набора для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF 488.